Liyofilize Peptitler ve Büyüme Faktörleri: Termodinamik Korunum

Peptit bağları sulu ortamda hidroliz ve deamidasyon gibi kimyasal tepkimelere açıktır. Bu nedenle sıvı formda bekleyen hassas peptitlerin zamanla yapısı değişebilir.

Peptit bağları sulu ortamlarda su moleküllerinin saldırısına açıktır. Liyofilize edilmiş kuru fazda serbest su bulunmadığı için hidrolitik reaksiyonlar büyük ölçüde yavaşlar; biyoaktif bileşenlerin liyofilize formda korunduğu EXORIS formülasyon yapısı hakkında detaylı bilgi edinebilirsiniz. Bu büyüme faktörlerinin doğal kaynağını kolostrum eksozomları yazımızda inceliyoruz.

Büyüme faktörleri gibi protein yapılı moleküller, sulu ortamda kimyasal ve fiziksel bozunmaya uğrayabilir. Liyofilizasyonda su uzaklaştırılır ve protein, genellikle bir şeker matriksinin oluşturduğu camsı katı içinde saklanır. Aşağıdaki çalışmalar rekombinant, ilaç geliştirme bağlamındaki proteinlerle yapılmıştır; EXORIS'e doğrudan uygulanamaz, yalnızca ilkeyi göstermektedir.

Rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (rhEGF) ile yapılan bir formülasyon çalışmasında, dondurarak kurutma sırasında en yüksek stabiliteye sükroz veya trehaloz eklenmesiyle ulaşıldığı bildirilmiştir. Kurutulmuş üründe RP-HPLC ile ölçülen bozunma hızının, sulu formülasyona göre 37°C'de yaklaşık 100 kat, 50°C'de yaklaşık 70 kat azalabildiği belirtilmiştir (Santana et al., Biologicals 2014).

Keratinosit büyüme faktörü-2 (KGF-2) ile yapılan çalışmada ise sükroz veya trehaloz ile hidroksietil nişasta karışımları denenmiştir. Bozunma hızlarının proteinin yapısının en çok bozulduğu ve hızlı β gevşemelerinin görüldüğü formülasyonlarda en yüksek olduğu bildirilmiştir. Baskın faktör ise proteinin cam-hava arayüzünde bulunan oranı olarak tanımlanmıştır (Devineni et al., Eur J Pharm Biopharm 2014).

Bu bulgular liyofilizasyonun tek başına bir koruma garantisi olmadığını gösterir. Yardımcı maddenin türü, kurutma protokolü ve camsı matriksin özellikleri sonucu belirler. Kuru fazın biyofiziği için liyofilize eksozom yazımızı da okuyabilirsiniz.

Kriyoprotektanlar, dondurma ve kurutma sırasında veziküllerin birbirine yapışmasını ve yapısal hasarı sınırlamak için eklenen maddelerdir. Eksozom çalışmalarında en çok incelenenler trehaloz gibi şekerlerdir. Bu etki, yayımlanmış çalışmalarda ölçülebilir parametrelerle bildirilmiştir.

Pankreas beta hücresi kaynaklı eksozom benzeri veziküllerde 25 mM trehaloz eklenmesinin partikül boyut dağılımını daralttığı ve mikrogram protein başına tekil partikül sayısını artırdığı bildirilmiştir. Tekrarlı dondurma-çözme döngüleri PBS içindeki veziküllerde partikül konsantrasyonunu ve dağılım genişliğini artırmış, trehaloz içeren örneklerde bu artış görülmemiştir. Kriyo-elektron tomografide lizis belirtisi izlenmemiştir (Bosch et al., Sci Rep 2016).

Farklı veziküllerle yapılan bir stabilite çalışmasında β-glukuronidaz enzimi veziküllere yüklenmiş ve enzim aktivitesi stabilite göstergesi olarak kullanılmıştır. Veziküllerin liyofilizasyon sırasında liposomlara kıyasla kendiliğinden kararlı olduğu, kriyoprotektanların bu etkiyi artırdığı bildirilmiştir (Frank et al., Sci Rep 2018).

B lenfosit kaynaklı veziküllerle yapılan başka bir çalışmada, şekerlerin dekstran ve glisinle birlikte kullanıldığı formülasyonların liyofilizasyon sonrası vezikül stabilitesini ve bütünlüğünü koruduğu bildirilmiştir (Susa et al., ACS Biomater Sci Eng 2023). Bu çalışmalar hücre kültürü kaynaklı vezikülleri kapsar; süt veya kolostrum kaynaklı veziküller için ayrı doğrulama gerekir.

Saklama koşulları vezikül özelliklerini değiştirebilir. Sekiz farklı saklama stratejisinin değerlendirildiği sistematik bir çalışmada, -80°C'de saklamanın zamana bağlı olarak vezikül konsantrasyonunu ve numune saflığını azalttığı bildirilmiştir. Ayrıca partikül boyutunu ve boyut değişkenliğini artırdığı ve zeta potansiyelini değiştirdiği gözlenmiştir (Gelibter et al., J Extracell Vesicles 2022).

Aynı çalışmada ilk dondurma-çözme döngüsünden sonra vezikül kaybı görüldüğü ve döngü sayısıyla partikül boyutunun arttığı belirtilmiştir. Test edilen koşulların hiçbirinin bu etkileri tamamen önlemediği bildirilmiştir. Yazarlar mümkün olduğunda taze işlenmiş numunelerin tercih edilmesini önermiştir.

Bu bulgu, kuru formun bir saklama seçeneği olarak neden araştırıldığını açıklar: Frank ve arkadaşları liyofilizasyonun oda sıcaklığında kolay saklama ve taşıma olanağı sunabileceğini belirtmiştir (Frank et al., 2018). Sonuç yine de formülasyona, vezikül kaynağına ve kurutma protokolüne bağlıdır.

Kullanım tarafında EXORIS'in iki fazlı yapısı bu mantıkla uyumludur: 3 liyofilize toz ile 3 PDRN aktivasyon flakonu ayrı saklanır ve aylık set içinde kullanım anında birleştirilir. 5 ml karışımın tamamı aynı akşam uygulanır, 15–20 dakika beklenir ve karışım 30 dakika içinde kullanılır. Gerekirse buzdolabında 2–8°C'de en fazla 1 gün saklanır. Ayrıntılar için kullanım yazımıza ve ürün sayfasına bakabilirsiniz. PDRN tarafı için PDRN nedir yazımızı okuyabilirsiniz.