Yüksek Saflıkta İzolasyon: Boyut Eleme Kromatografisi ve TFF Standartları

TFF vezikülleri membran üzerinde paralel akışla konsantre eder, SEC ise kolonda büyük vezikülleri serbest proteinlerden boyuta göre ayırır. İki basamak birlikte kullanıldığında vezikül preparasyonunun saflığı artırılmaya çalışılır.

Klasik kaba santrifüjlerde uygulanan yüksek g-kuvvetleri nano-veziküllerin küresel yapısını deforme edebilir.

TFF (Teğetsel Akış) membran boyunca sıvıyı paralel akıtır; gözenek tıkanmasını önleyerek vezikülleri nazikçe zenginleştirir. Ardından gelen SEC kolonları büyük vezikülleri ilk fraksiyonlarda toplarken serbest proteinleri tutar; bu saflaştırma standartlarıyla hazırlanan EXORIS liyofilize eksozom serumu, yüksek vezikül saflığı ve membran bütünlüğünü hedefler (Böing et al., 2014). Saflaştırılan veziküllerin boyut dağılımının nasıl ölçüldüğünü partikül karakterizasyonu yazımızda ele alıyoruz.

TFF, sıvıyı bir membran yüzeyine paralel akıtarak vezikülleri konsantre eden bir yöntemdir. Ultrasantrifüj ise yüksek ivmeyle vezikülleri çöktürür. İki yöntem de yaygındır, ancak çalışma mantıkları ve numune üzerindeki etkileri farklıdır.

Hücre kültürü ortamında TFF ile ultrasantrifüjü karşılaştıran bir çalışmada, TFF'nin benzer fizikokimyasal özellikteki veziküllerin daha yüksek verimle konsantre edildiği bildirilmiştir. Aynı çalışmada 15 nm altındaki tekil makromolekül ve agregatların daha az olduğu, partiden partiye tutarlılığın arttığı ve işlem süresinin yarıya inerek 1 saate düştüğü belirtilmiştir (Busatto et al., Cells 2018). Yazarlar TFF'yi ultrasantrifüje göre daha verimli, ölçeklenebilir ve nazik bir yöntem olarak tanımlamıştır.

Yine de ultrasantrifüj sahada hâlâ en yaygın yöntemdir. Dünya genelinde yapılan bir ankette araştırmacıların %81'i ultrasantrifüj kullandığını, %59'u ise birden fazla yöntemi birleştirdiğini bildirmiştir (Gardiner et al., J Extracell Vesicles 2016). Bu nedenle bir saflaştırma zincirinde yöntemlerin birbirinin yerine değil, birbirini tamamlayacak şekilde seçilmesi yaygın bir yaklaşımdır.

Ölçeklenebilirlik üretim açısından önemlidir. Büyük hacimli sıvılarda TFF'nin uygulanabildiği gösterilmiştir. Süt gibi büyük hacimle çalışılan kaynaklarda bu özellik, süt kaynaklı eksozomların standartlaştırılabilirliği için de bir avantaj olarak değerlendirilir.

Ultrafiltrasyon (UF) numuneyi önce 10 kDa gibi bir eşikte filtreleyerek konsantre eder. SEC ise konsantre örneği kolondan geçirerek büyük vezikülleri serbest proteinlerden ayırır. Birlikte kullanıldığında vezikül fraksiyonu ile serbest protein fraksiyonu ayrı ayrı elde edilebilir.

Bronş epiteli hücre kültürü ortamıyla yapılan bir çalışmada, UF-SEC ile elde edilen veziküllerin verim ve EV/protein saflık oranının ultrasantrifüjle elde edilenlere göre yüksek eğilimde olduğu bildirilmiştir (Benedikter et al., Sci Rep 2017). Yazarlar UF-SEC'i ultrasantrifüje yararlı bir alternatif olarak değerlendirmiştir.

Aynı çalışmada vezikül fraksiyonu ile serbest protein fraksiyonunun hücreler üzerinde farklı sonuçlar verdiği gözlenmiştir. Serbest protein fraksiyonu medyumdaki IL-8 düzeyini artırmış, vezikül fraksiyonu ise monositlerin endotele yapışmasını artırmıştır. Bu, veziküllerin serbest proteinlerden ayrılmasının neden önemsendiğini gösterir; karışık bir preparasyondan gelen sinyalin hangi bileşene ait olduğu ancak ayrım yapılırsa anlaşılabilir.

Bu çalışma laboratuvar hücre kültürü bağlamındadır ve cilt bakım ürünlerinin etkisine kanıt değildir. Yöntemsel çıkarım şudur: saflık değerlendirmesinde yalnızca vezikül sayısına değil, vezikül sayısının protein miktarına oranına da bakılır. Bu oran saflığın yaygın bir göstergesidir.

Sütteki kazein, eksozom saflığını belirlemede en büyük engellerden biridir. Bu nedenle süt kaynaklı veziküllerde saflaştırma genellikle kazeinin uzaklaştırılmasıyla başlar.

İnek sütünden vezikül izolasyonu yöntemlerini karşılaştıran bir çalışmada kazeinin, saf süt kaynaklı vezikül elde etmenin ana engeli olduğu belirtilmiştir. Asetik asit çöktürmesinin kazein uzaklaştırmada en iyi yöntem olduğu bulunmuştur. Miligram protein başına vezikül sayısı saflığın göstergesi olarak kullanılmış ve SEC tabanlı kolonun daha saf ve daha yüksek miktarda vezikül topladığı bildirilmiştir (Morozumi et al., J Dairy Sci 2021).

Başka bir çalışmada asit işlemi ve ultrasantrifüjle inek sütünden izole edilen veziküllerin küresel yapıda olduğu, yaklaşık 120 nm çapında ölçüldüğü ve tetraspanin gibi tipik vezikül belirteçlerini taşıdığı bildirilmiştir. Bu yöntemle elde edilen preparasyonun önceki yönteme göre daha saf olduğu belirtilmiştir (Somiya et al., J Extracell Vesicles 2018).

Bu çalışmalar inek sütüyle yapılmıştır; kolostrum için ayrı yöntem doğrulaması gerekir. Ayrıca izolasyon yöntemlerinin tamamında karışık bir vezikül popülasyonunun elde edilebildiği, evrensel tek bir yöntemin bulunmasının zor olabileceği de literatürde ifade edilmiştir (Konoshenko et al., Biomed Res Int 2018). Kolostrum kaynağı için kolostrum eksozomu yazımızı, ölçüm tarafı için partikül boyutu ve NTA yazımızı okuyabilirsiniz.