Vezikül Biyofiziği ve Stokes-Einstein Karakterizasyonu: Monodispers Partikül Dinamiği

NTA, lazerle aydınlatılan nano-partiküllerin saçtığı ışığı kamerayla izleyerek Brownian hareketlerinden boyutu hesaplayan optik bir yöntemdir.

Nano-ölçekli partiküllerin mikroskop altındaki hareketlerini görünür kılan optik bir analiz yöntemidir. Analiz edilen veziküllerin biyolojik kökeni için kolostrum eksozomları yazımıza bakabilirsiniz.

Lazer demeti altındaki eksozomlar ışığı saçar ve sCMOS kamera sensöründe parlak noktalar olarak izlenir. Yazılım partiküllerin Brownian yer değiştirmesini izleyerek difüzyon katsayısını (D) hesaplar; bu analitik boyut profili ve monodispers dağılım standartları EXORIS ürün bileşenlerinde doğrulanmıştır. Ölçülen vezikül popülasyonunun nasıl saflaştırıldığını SEC ve TFF izolasyon yazımızda bulabilirsiniz.

NTA, protokol iyi tanımlandığında tekrarlanabilir sonuç verebilen bir yöntemdir; ancak sonuç cihaza, yazılım ayarına ve numuneye bağlı olarak değişir. Bu nedenle tek bir NTA değeri, tek başına kesin bir boyut ölçüsü olarak okunmamalıdır.

12 laboratuvarın katıldığı bir ortaklaşa çalışmada, NTA ile modal partikül boyutu ölçülmüş ve protokol geliştirme sürecinin katılımcılar arasında yüksek düzeyde tekrarlanabilir sonuçlara yol açtığı bildirilmiştir (Hole et al., J Nanopart Res 2013). Bu çalışma eksozom değil, farklı boyut ve malzemedeki nanopartikülleri kullanmıştır. Yine de ölçüm protokolünün standartlaştırılmasının önemini gösterir.

İki farklı NTA cihazını karşılaştıran bir çalışmada, NanoSight NS300 cihazının polistiren ve silika nanokürelerin konsantrasyonunu 2,0–2,1 kat fazla ölçtüğü bildirilmiştir. Seyreltme serilerinde ZetaView cihazının konsantrasyon doğruluğu daha yüksek bulunmuştur (% BIAS 2,7–8,5; NanoSight için 32,9–36,8). Buna karşılık TEM ile karşılaştırıldığında boyut ölçümünde NanoSight daha doğru bulunmuştur (Bachurski et al., J Extracell Vesicles 2019).

Aynı çalışmada her iki cihazın da TEM ve SP-IRIS yöntemlerine kıyasla 60 nm altındaki tepe eksozom çapını bildiremediği belirtilmiştir. Eksozomların tipik aralığı 30–150 nm olarak tanımlandığı için bu sınır önemlidir. En küçük veziküllerin NTA ile eksik sayılabileceği anlamına gelir.

Zeta potansiyeli, bir partikülün yüzey yükünün ölçüsüdür ve süspansiyonun kolloidal kararlılığını değerlendirmek için kullanılır. Değer ne kadar uç ise partiküller arasındaki elektrostatik itme o kadar güçlüdür. Bu itme, partiküllerin birbirine yapışıp kümelenme eğilimini azaltır.

Ayarlanabilir dirençli darbe algılama (TRPS) yöntemiyle boyut ve yüzey yükü, partikül partikül ve aynı anda ölçülebilir. Bu yaklaşım liposom karışımları ve plazmadaki ekstraselüler veziküller üzerinde gösterilmiştir (Vogel et al., Sci Rep 2017). Toplu ölçüm yapan yöntemler ortalama bir değer verir; tekil partikül ölçümü ise popülasyonun içindeki farklı alt grupları ayırt etmeye olanak tanır.

Saklama koşullarının vezikül özelliklerini değiştirebildiği de bildirilmiştir. İnsan plazması ve fare mikroglia kültüründen elde edilen veziküllerle yapılan bir çalışmada, -80°C'de saklamanın partikül boyutunu ve boyut değişkenliğini artırdığı, zeta potansiyelini de değiştirdiği gözlenmiştir (Gelibter et al., J Extracell Vesicles 2022). Bu nedenle boyut ve yük ölçümlerinin hangi aşamada ve hangi saklama koşulundan sonra yapıldığı raporda belirtilmelidir.

Liyofilize bir ürünün rekonstitüsyon sonrası boyut dağılımı da aynı mantıkla değerlendirilir. Ölçüm, kuru ürün sulandırıldıktan sonra tekrar yapılır ve sonuç başlangıç değerleriyle karşılaştırılır.

MISEV (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles), Uluslararası Ekstraselüler Vezikül Derneği'nin (ISEV) yayımladığı bir rehberdir. Veziküllerin üretimi, ayrıştırılması ve karakterizasyonu için mevcut yöntemleri, avantaj ve sınırlılıklarıyla birlikte özetler. Rehber ilk olarak 2014'te, ardından 2018 ve 2023'te güncellenmiştir (Welsh et al., J Extracell Vesicles 2024).

MISEV2018, bir işlevin eksozomlara atfedilebilmesi için ham, kirlenmiş ve heterojen bir preparasyondaki gözlemin ötesinde belirli bilgilerin raporlanması gerektiğini vurgular (Théry et al., J Extracell Vesicles 2018). MISEV2023 ise vezikülleri vezikül olmayan ekstraselüler partiküllerden ayırmanın ve karakterize etmenin hâlâ zor olduğunu belirtir.

Pratikte bu, bir boyut değerinin tek başına yeterli olmadığı anlamına gelir. Ürün kalitesi okunurken boyut dağılımı, partikül konsantrasyonu, morfoloji ve saflık verileri birlikte değerlendirilir. Dünya genelinde araştırmacılar arasında yapılan bir ankette yalnızca %9'unun tek bir karakterizasyon yöntemi kullandığı, diğerlerinin iki veya daha fazla yöntemi birlikte kullandığı bildirilmiştir (Gardiner et al., J Extracell Vesicles 2016).

Bu yazıdaki bilgiler genel bilimsel çerçevedir. Boyut ve saflık verileri bir üretim kalitesi göstergesidir; ürünün cilt üzerindeki etkisine kanıt oluşturmaz. Saflaştırma tarafı için SEC ve TFF izolasyon yazımıza, ürün bilgisi için EXORIS ürün sayfasına bakabilirsiniz.